Các phương pháp sinh học phân tử và nghiên cứu sử dụng chúng

Các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử đóng một vai trò quan trọng trong y học hiện đại, tội phạm và sinh học. Nhờ những tiến bộ trong lĩnh vực nghiên cứu DNA và RNA, một người có thể nghiên cứu bộ gen của cơ thể, xác định tác nhân gây bệnh, nhận ra axit nucleic mong muốn trong một hỗn hợp axit, vv

Các phương pháp phân tử sinh học của nghiên cứu. Nó là gì?

Trở lại những năm 70 và 80, các nhà khoa học đã lần đầu tiên giải mã hệ gen người. Sự kiện này đã tạo đà cho sự phát triển của kỹ thuật di truyền và sinh học phân tử. Nghiên cứu về đặc tính của DNA và RNA đã dẫn đến thực tế là bây giờ có thể sử dụng các axit nucleic này để chẩn đoán bệnh, để nghiên cứu gen.

Chuẩn bị DNA và RNA

Các phương pháp chẩn đoán sinh học phân tử đòi hỏi sự hiện diện của vật liệu ban đầu: thường thì chúng là các axit nucleic. Có một số cách cô lập các chất này từ các tế bào của sinh vật sống. Mỗi người trong số họ có những lợi thế và bất lợi của nó, và điều này phải được xem xét khi lựa chọn phương pháp cô lập axit nucleic ở dạng tinh khiết.

1. Chuẩn bị DNA theo Marmur. Phương pháp này bao gồm điều trị hỗn hợp các chất với rượu, do đó DNA tinh khiết kết tủa. Bất lợi của phương pháp này là sử dụng chất gây nghịch: phenol và chloroform.

2. Phân lập DNA theo Boom. Chất cơ bản được sử dụng ở đây là guanidine thiocyanate (GuSCN). Nó thúc đẩy sự kết tủa axit deoxyribonucleic trên các chất chuyên dụng, từ đó nó có thể được thu thập với một chất đệm đặc biệt. Tuy nhiên, GuSCN là một chất ức chế PTC, và thậm chí một phần nhỏ của nó, bị mắc kẹt trong DNA bị kết tủa, có thể ảnh hưởng đến quá trình phản ứng chuỗi polymerase, đóng một vai trò quan trọng trong công việc với axit nucleic.

3. Lượng mưa của tạp chất. Phương pháp này khác với các phương pháp trước đó trong đó các phân tử của axit deoxyribonucleic tự kết tủa, nhưng các tạp chất. Để làm được điều này, sử dụng bộ trao đổi ion. Bất lợi là không phải tất cả các chất có thể giải quyết.

4. Kiểm tra khối lượng. Phương pháp này được sử dụng trong những trường hợp này khi không cần thông tin chính xác về thành phần của phân tử DNA, nhưng cần phải có một số dữ liệu thống kê. Điều này được giải thích bởi thực tế là cấu trúc của axit nucleic có thể bị hư hỏng bằng cách xử lý chất tẩy rửa, đặc biệt là với kiềm.

Phân loại các phương pháp nghiên cứu

Tất cả các phương pháp sinh học phân tử sinh học được chia thành ba nhóm lớn:

1. Khuếch đại (sử dụng nhiều loại enzyme). Điều này bao gồm phản ứng PCR-polymerase chuỗi, đóng một vai trò lớn trong nhiều phương pháp chẩn đoán.

2. Không có tên gọi. Nhóm các phương pháp này liên quan trực tiếp đến công việc của hỗn hợp các axit nucleic. Ví dụ là 3 loại blotting, in situ hybridization, vv

3. Các phương pháp dựa trên việc công nhận một tín hiệu từ một phân tử thăm dò kết hợp với một đầu dò DNA hoặc RNA cụ thể. Một ví dụ là một hệ thống lai ghép trong một giải pháp Hybride Capture System (hc2).

Enzyme có thể được sử dụng trong các phương pháp sinh học phân tử

Nhiều phương pháp chẩn đoán phân tử liên quan đến việc sử dụng một loạt các enzyme. Dưới đây là những sử dụng phổ biến nhất:

1. Hạn chế - "cắt" phân tử DNA vào các phần cần thiết.

2. DNA polymerase - tổng hợp một phân tử kép của axit deoxyribonucleic.

3. Reverse transcriptase (revertase) - dùng để tổng hợp DNA trên ma trận RNA.

4. DNA ligase - chịu trách nhiệm tạo thành các liên kết phosphodiester giữa các nucleotide.

5. Exonuclease - loại bỏ các nucleotide khỏi các phần cuối của phân tử deoxyribonucleic acid.

PCR là cách chính để khuếch đại DNA

Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) được tích cực sử dụng trong sinh học phân tử hiện đại. Đây là một phương pháp trong đó một số lượng lớn các bản sao có thể được lấy từ một phân tử DNA đơn lẻ (khuếch đại các phân tử).

Các chức năng chính của PCR là:

- Chẩn đoán bệnh;

Nhân bản ADN, gien.

Phản ứng chuỗi polymerase đòi hỏi các yếu tố sau: phân tử DNA nguyên bản, polymerase DNA có khả năng chịu nhiệt (Taq hoặc Pfu), deoxyribonucleotide phosphates (nguồn gốc nitơ), primers (2 primers trên mỗi phân tử DNA) và hệ thống đệm, trong đó có thể thực hiện Trong tất cả các phản ứng.

PCR bao gồm ba giai đoạn: denaturation, ủ các mồi và sự kéo dài.

1. Sự biến dạng. Ở nhiệt độ 94-95 độ Celsius, sự phá vỡ các liên kết hydro giữa hai chuỗi DNA tiếp tục, và kết quả là chúng ta nhận được hai phân tử đơn chuỗi.

2. Làm nóng lớp sơn lót. Ở nhiệt độ 50-60 độ Celsius, các lớp sơn lót được gắn ở đầu của các phân tử axit nucleic đơn lẻ theo loại tính bổ sung.

3. Sự kéo dài. Ở nhiệt độ 72 độ, sự tổng hợp của các phân tử có sợi đôi con của axit deoxyribonucleic xảy ra.

Trình tự DNA

Các phương pháp sinh học phân tử thường đòi hỏi kiến thức về trình tự nucleotide trong một phân tử deoxyribonucleic acid. Sequencing được sử dụng để xác định mã di truyền . Chẩn đoán phân tử của tương lai sẽ dựa trên kiến thức thu được trong việc xác định trình tự của một người.

Các loại trình tự sau đây được phân biệt:

• Sequencing của Maxam-Gilbert;
• Sequencing của Sanger;
• Pyrosequencing;
• Trình tự nano.